پایان نامه :غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه

پایان نامه رشته :زیست شناسی

گرایش :میکروبیولوژی

عنوان : غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه

دانشگاه آزاد اسلامی

واحد علوم دارویی

دانشکده علوم وفناوری‌های نوین، گروه زیست شناسی

 

پایان نامه برای دریافت درجه کارشناسی ارشد((M.Sc))

گرایش: میکروبیولوژی

 

عنوان:

غربالگری اکتینومایست‌های نگهداری شده در کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران برای تولید ترکیبات ضد سرطان ریه

 

استاد راهنما:

جناب آقای دکتر جواد حامدی

 

اساتید مشاور:

جناب آقای دکتر سید مهدی رضایت سرخ آبادی

سرکار خانم دکتر فاطمه محمدی پناه

سال تحصیلی    ۹۲-۱۳۹۱

 
 
 

فهرست مطالب

عنوان                                                                                                           صفحه
چکیده۱
فصل اول: کلیات                                                                                           
۱-۱- سرطان.۳
۱-۲- علل سرطان.۳
۱-۳- خصوصیات سلول توموری.۵
۱-۴- روش ‌های درمان سرطان۶
۱-۵- تاریخچه ی شیمی درمانی ۶
۱-۶- مقاومت دارویی.۷
۱-۷- فارماکولوژی پایه داروهای شیمی درمانی سرطان.۸
۱-۷-۱- داروهای آلکیله کننده.۸
۱-۷-۲- آنتی متابولیت‌ها.۸
۱-۷-۳- هورمون‌ها۹
۱-۷-۴- فراورده‌‌های گیاهی.۹
۱-۷-۵- آنتی بیوتیک‌های ضدسرطان۱۰
۱-۷-۵-۱- اکتینومایسین۱۱
۱-۷-۵-۱-۱- داکتینومایسین۱۱
۱-۷-۵-۲-آنتراسیکلین۱۳
۱-۷-۵-۲-۱-دانوروبیسین.۱۴
۱-۷-۵-۲-۲-دوکسوروبیسین هیدروکلراید.۱۶
۱-۷-۵-۳- میترامایسین۱۷
۱-۷-۵-۴ بلئومایسین سولفات.۱۹
۱-۷-۵-۵- میتومایسین‌ها.۲۱
۱-۷-۵-۵-۱ میترامایسین C.22
۱-۷-۵-۶- استرپتوزوستین۲۲
۱-۸-سرطان ریه.۲۳
۱-۸-۱- علائم سرطان ریه. ۲۶
۱-۸-۲- سرطان در ایران. ۲۶
۱-۹-اکتینومیست‌ها.۲۸
۱-۹-۱-متابولیت‌های ثانویه‌ی اکتینومیست‌ها۳۰
۱-۱۰-هدف از پژوهش۳۳         
فصل دوم: پیشنه‌ی تحقیق                                                                                               
فصل سوم: مواد و روش­ها                                                                                              
۳-۱- ترکیبات استفاده شده.۳۹
۳-۲- دستگاه های استفاده شده۴۲
۳-۳- سویه‌های اکتینومیست.۴۳
۳-۴- آماده‌سازی محیط کشت تولید اسپور باکتری.۴۳
۳-۵- آماده‌سازی محیط پیش کشت۴۴
۳-۶- آماده‌سازی محیط کشت تخمیر.۴۴
۳-۷- احیا و کشت سویه۴۵
۳-۸- تهیه پیش کشت ۴۵
۳-۹- تولید متابولیت‌ها۴۵
۳-۱۰- استخراج متابولیت‌ها.۴۵
۳-۱۱- نگهداری عصاره‌ها.۴۶
۳-۱۲- غربالگری اولیه، ارزیابی فعالیت سمیت.۴۶
۳-۱۲-۱- کشت آرتمیا.۴۶
۳-۱۲-۲- آزمون ارزیابی سمیت در آرتمیا.۴۷
۳-۱۳- غربالگری ثانویه، ارزیابی سمیت در کشت سلولی.۴۸
۳-۱۳-۱- انتخاب دودمان سلولی. ۴۸
۳-۱۳-۱-۱ محیط کشت.۴۹
۳-۱۳-۱-۱-۱- مراحل تهیه محیط کشت دودمان سلولی A549.49
۳-۱۳-۱-۱-۲-تجدیدکشت دودمان سلولی A54950
۳-۱۳-۱-۱-۳- شمارش سلول‌ها و بررسی میزان فعالیت سلول.۵۱
۳-۱۳-۲- تهیه محلول تریپسین۵۲
۳-۱۴- آزمون MTT53
۳-۱۵- شمارش سلول برای انجام آزمونMTT.54
۳-۱۶- روش انجام آزمون MTT دراین پژوهش۵۴
۳-۱۷- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها تیمار شده با عصاره اکتینومیست‌ها۵۵
۳-۱۸- شناسایی سویه‌های منتخب اکتینومیست.۵۶
۳-۱۸-۱- بررسی مورفولوژی میکروسکوپی ۵۶
۳-۱۸-۲- بررسی میسلیوم‌های هوایی و آرایش زنجیره اسپوری۵۶
۳-۱۸-۳- بررسی رشد میسلیومی در محیطISP2 broth56
۳-۱۹-  مطالعه شیمیوتاکسونومی۵۶
۳-۱۹-۱- تهیه بیومس برای تعیین ایزومر دی آمینوپامیلیک اسید(DAP).56
۳-۱۹-۲- تعیین ایزومر DAPموجود در دیواره سلولی ۵۷
۳-۲۰- شناسایی توالی نوکلئوتیدی ژن ۱۶S rRNA سویه‌های منتخب. ۵۸
۳-۲۰-۱- تهیه محیط کشت Luria Broth(LB).58
۳-۲۰-۲- تهیه زیست توده برای مطالعات فیلوژنتیک۵۹
۳-۲۰-۳- استخراج DNA59
۳-۲۰-۴- تائید بررسی کیفیت استخراج DNA61
۳-۲۰-۴-۱- تهیه ژل آگاروز۶۱
۳-۲۰-۴-۱-۱- تهیه بافر(TAE)Tris-Acetate-EDTA61
۳-۲۰-۵- انجام فرایند واکنش زنجیره پلیمراز(PCR)62
۳-۲۰-۵-۲- شرایط واکنش PCR62
۳-۲۰-۵-۳- بررسی محصولات PCR.63
۳-۲۰-۵-۴- خالص سازی محصولات PCR.63
۳-۲۰-۶- تعیین توالی نوکلئوتیدی قطعات تکثیر شده از ژن ۱۶S rRNA.63
۳-۲۰-۷- مقایسه توالی نوکلئوتید ژن ۱۶S rRNA سویه‌های اکتینومایست منتخب۶۳
فصل چهارم: نتایج                                                                                                       
۴-۱- شرایط پیش تخمیر و تخمیر و میزان متابولیت تولید شده توسط۴۰ سویه  اکتینومیست‌ بررسی شده در این پژوهش۶۵
۴-۲- نتایج حاصل از تست ارزیابی سمیت متابولیت‌های ثانویه.۶۸
۴-۳- نتایج مربوط به بررسی ریخت شناسی سلول‌ها در تست سمیت سلولی. ۷۱
۴-۴- نتایج مربوط به تست سمیت سلولی با روش MTT.72
۴-۵- بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار با عصاره سویه‌ی اکتینومیست‌های منتخب۷۴
۴-۶- شناسایی اکتینومیست‌های منتخب.۷۴
۴-۶-۱- بررسی ریخت شناسی اکتینومیست‌های منتخب.۷۴
۴-۶-۲- تعیین ایزومر DAP موجود در دیواره سلولی ۷۶
۴-۶-۳- بررسی فیلوژنتیکی اکتینومیست‌های منتخب.۷۷
۴-۶-۳-۱- تائید استخراجDNA اکتینومیست‌های منتخب۷۷
۴-۶-۴- تائید استخراج ژن۱۶S rRNA از ژل آگاروز۷۷
۴-۶-۴-۱- نتایج مربوط به توالی خوانی ژن ۱۶S rRNA.78
 فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری                                                                                      
 منابع. ۹۱
چکیده انگلیسی.۱۰۱
پیوست‌ها.۱۰۲
فهرست جداول
عنوان                                                                                                                  صفحه
جدول ‏۱‑۱: میزان شیوع و مرگ و میر ناشی از انواع سرطان در هر دو جنس زن ومرد. ۲۵
جدول ‏۱‑۲: تغییرات تنوع سرطان در ایران در طی سال‌های ۱۳۷۶-۱۳۱۸ ۲۷
جدول ‏۱‑۳:گروه‌های مختلف اکتینومیست‌ها ۲۹
جدول ‏۱‑۴: تعدادی از متابولیت‌های استخراج شده توسط اکتینومیست‌ها ۳۲
جدول ‏۳‑۱:مواد شیمایی استفاده شده ۳۹
جدول ‏۳‑۲:دستگاه‌های استفاده شده ۴۲
جدول ‏۳‑۳:ترکیبات محیط کشت ISP2 اصلاح شده ۴۴
جدول ‏۳‑۴:ترکیبات محیط پیش تخمیر. ۴۵
جدول ‏۳‑۵:نمک‌های مورد نیاز برای تهیه آب نمک دریایی مصنوعی ۴۶
جدول ‏۳‑۶:ترکیبات مورد استفاده درتهیه محیط کشت دودمان A549. 49
جدول ‏۳‑۷:ترکیبات محیط کشت. ۵۸
جدول ‏۴‑۱:نتایج حاصل از مرحله ی تولید واستخراج متابولیت‌های ثانویه. ۶۴
جدول ‏۴‑۲:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین ۴۰-۵۹% (محدوده اثر خوب). ۶۷
جدول ‏۴‑۳:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین ۳۹-۲۰% (محدوده اثر متوسط). ۶۹
جدول ‏۴‑۴:درصد کشندگی در عصاره‌ها با محدوده اثری بین ۰-۱۹% (محدوده اثرضعیف). ۷۰
جدول ‏۴‑۵: نتایج مربوط به بررسی مرفولوژی سلول پس از تیمار با عصاره‌ها ۷۰
جدول ‏۴‑۶: نتایج مربوط به مقایسه مقدار جذب بین عصاره‌ها با شاهد. ۷۲
جدول ‏۴‑۷: شماره دسترسی در Gene Bank ومیزان تشابه اکتینومیست‌های منتخب با اکتینومیست‌های ثبت شده براساس ترادف نوکلئوتید‌های ژن ۱۶S rRNAدر ژنوم. ۸۰
فهرست نمودارها
عنوان                                                                                                                  صفحه
نمودار ‏۴‑۱:مقایسه میانگین مقدار جذب بین عصاره‌های سویه‌هایی که ۰۵/۰≥p داشتندبا شاهد(A549). 73
فهرست اشکال                           صفحه
شکل ‏۱‑۱: ساختمان شیمیایی داکتینومایسین ۱۲
شکل ‏۱‑۲: ساختمان شیمیایی دانوروبیسین ۱۴
شکل ‏۱‑۳: ساختمان شیمیایی دوکسوروبیسین ۱۶
شکل ‏۱‑۴: ساختمان شیمیایی میترامایسین ۱۷
شکل ‏۱‑۵:ساختمان شیمیایی بلئومایسین ۱۸
شکل ‏۱‑۶:ساختمان شیمیایی میتومایسین ۲۰
شکل ‏۱‑۷: ساختمان شیمیایی استرپتوزوستین ۲۲
شکل ‏۳‑۱: این تصاویر به عنوان نمونه از میزان آسیب می‌باشد که برای درک بهتر هر مفهوم آسیب دیدگی۵۴
شکل ‏۴‑۱: تصاویر مربوط به بررسی ریخت‌شناسی سلول‌ها پس از تیمار سلول A549 با عصاره باکتری‌ها.۷۳
شکل ‏۴‑۲: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 863. 74
شکل ‏۴‑۳: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 919. 74
شکل ‏۴‑۴: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 877. 74
شکل ‏۴‑۵: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 676. 75
شکل ‏۴‑۶: بررسی ریخت شناسی سویه UTMC 638. 75
شکل ‏۴‑۷: مربوط به استخراج DNA اکتینومیست‌های منتخب. ۷۶
شکل ‏۴‑۸: مربوط به استخراج ژن ۱۶S rRNA می‌‌باشد. ۷۷
فهرست پیوست‌ها
پیوست‏۴‑۱ ۱۰۲
پیوست‏۴‑۲ ۱۰۲
پیوست‏۴‑۳ ۱۰۶
پیوست‏۴‑۴. ۱۲۱
 

چکیده

در این پژوهش توان تولید ترکیبات ضد سرطان ریه در اکتینومیست‌های بومی ایران که در مرکز کلکسیون میکروارگانیسم‌های دانشگاه تهران(UTMC) نگهداری می‌شوند مورد بررسی قرار گرفت.
ابتدا ۴۰ سویه اکتینومیست که در دمای ۷۰- درجه سانتیگراد نگهداری می‌شدند به صورت تصادفی انتخاب شدند و مراحل اسپورزایی، پیش تخمیر و تخمیر آنها انجام شد. میزان سمیت عصاره‌های استخراج شده به دو روش  تست آرتمیا (assay Brine Shrimp) و تست رنگ سنجی (MTT) برروی دودمان سلولی A549 سنجیده شد. پنج سویه UTMC 863،UMC 877 ،UTMC 919 ، UTMC 638، UTMC 676 اثرات کشندگی روی دودمان سلولی A549 داشتند که نتایج تست سلولیMTT، نتایج بررسی ریخت شناسی سلولی را نیز تایید کرد. پنج سویه منتخب تحت شناسایی مورفولوژیک و مولکولی قرار گرفتند. نتایج این بررسی نشان داد که سویه UTMC 676 دارای ۸۶/۹۹% شباهت به Streptomyces aureoverticillatus (شماره دسترسی AY999774) و سویه UTMC 638 دارای ۷۸/۹۸% شباهت به Streptomyces cacaoi subsp. cacaoi (شماره دسترسی AB184115) همچنین سویه های UTMC 863 وUTMC 877 به ترتیب دارای ۸۵/۹۹% و۱۰۰% شباهت به Nocardia carnea (شماره دسترسی BAFV01000017) و نیز سویه UTMC 919 دارای ۲۹/۹۹% شباهت به سویه Kribbella sancticallisti (شماره دسترسی AM778577) می باشند. باتوجه به اینکه اکتینومیست‌ها توانایی تولید ترکیبات ضد سرطان را دارا می‌باشند،عصاره‌ی سویه‌های تولید کننده بدست آمده در این پروژه فعالیت ضد سرطانی خوبی را نشان دادند .  نیاز به کشف داروهای جدید به علت مقاومت دارویی سرطان‌ها هرچه بیشتر احساس می‌شود از این رو پیشنهاد می‌شود عصاره این متابولیت‌ها تخلیص و شناسایی شوند.
کلمات کلیدی: اکتینومیست، غربالگری، دودمان سلولی A549، تست آرتمیا، تست MTT، ترکیبات ضد سرطان

فصل اول:

کلیات

۱-۱-  سرطان

سرطان نوعی بیماری است که در آن کنترل طبیعی مکانیسم های بقاء، تکثیر و تمایز سلول‌ها دچار اختلال می شود. سلول‌هایی که سرطانی شده‌اند،‌ معمولاً آنتی ژن‌های سطحی را بروز می‌دهند که ممکن است از نوع جنینی باشند یا سایر علایم عدم بلوغ را نشان دهند. همچنین ممکن است سایر علائم ناهنجاری‌های کمی و کیفی کروموزمی شامل جا‌‌به‌‌جا‌یی‌‌های مختلف و ظهور توالی‌های تکثیر یافته برخی ژن‌ها بروز کند. امروزه می‌دانیم که زیرمجموعه کوچکی از سلول‌ها موسوم به سلول‌های بنیادین تومور، در داخل یک توده توموری قرار دارند. این سلول‌ها علاوه بر این که دست خوش چرخه‌های مکرر تکثیر قرار می‌گیرند، ممکن است به محل‌های دور دست در بدن مهاجرت کرده و کلنی‌هایی را در اعضای مختلف تشکیل دهند این فرآیند، متاستاز نامیده می‌شود. به این ترتیب، این سلول‌های بنیادین تومور توان تشکیل کلنی دارند و مشخصه‌ی آنها، اختلالات کروموزومی است که ناپایداری ژنتیکی آنها را نشان می دهد. ناپایداری ژنتیکی به این سلول‌ها اجازه می‌دهد که نسبت به شیمی درمانی و پرتو درمانی مقاومت نشان دهند. فرایند‌های تهاجمی و متاستاز وهمچنین یک سری اختلالات متابولیک ناشی از سرطان، موجب بیماری و سرانجام مرگ بیمار می‌شوند، مگر آن که بتوان توسط درمان، سرطان را ریشه کن نمود (۷).
تعداد صفحه : ۱۲۹
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***

مطلب پیشنهادی
پایان نامه رشته :زیست شناسی عنوان : طراحی و ساخت…
Cresta Posts Box by CP