پایان نامه ارشد:انالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه خارج سلولی ۱۶۶CD در میزبان پروکاریوتی

پایان نامه رشته :بیوتکنولوژی

گرایش :میکروبی

عنوان : انالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه خارج سلولی ۱۶۶CD  در میزبان پروکاریوتی

دانشگاه ازاد اسلامی

واحد دامغان

دانشکده علوم پایه

رساله برای دریافت درجه کارشناسی ارشد در رشته بیوتکنولوژی

گرایش میکروبی

عنوان

 انالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ و بیان ناحیه خارج سلولی ۱۶۶CD  در میزبان پروکاریوتی

استاد راهنما

دکتر محمد مهدی فرقانی فرد

 

استاد مشاور

دکتر عباس زادگان

 

 دی ۱۳۹۳

 

فهرست مطالب

چکیده فارسی ۱

فصل اول: مقدمه

۱-۱ سرطان    .  ۳

۱-۲ سرطان . ۴

۱-۳ کولورکتال. ۴

۱-۴ سرطان کوورکتال. ۴

۱-۴-۲- عوامل خطرزا در ابتلا به سرطان کولورکتال ۵

۱-۴-۳- تغییرات مولکولی در سرطان ۷

۱-۳-۴ تشخیص سرطان کولورکتال . ۹

۱-۴-۴- علائم و نشانه ها. ۱۱

۱-۴-۶- روش های درمانی برای سرطان . ۱۴

۱-۴-۶-۱- جراحی ۱۴

۱-۴-۶-۲- شیمی درمانی.۱۴

۱-۴-۶-۳- درمان بیولوژیکی۱۴

۱-۴-۶-۲- پرتو درمانی (درمان با اشعه) . ۱۴

۱-۲ پروتئین CD166 15

۱-۴ مساله تحقیق . ۱۷

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

۲-۱ ALCAM در درمان سرطان ۱۹

فصل سوم: مواد و روش ها

۳-۱ مواد مورد استفاده. ۲۴

۳-۱-۱ باکتری مورد استفاده. ۲۴

۳-۱-۲ پلاسمید ۲۴

۳-۱-۳ انزیم ۲۵

۳-۱-۴ کیت های ازمایشگاهی. ۲۵

۳-۱-۵ انتی بیوتیک ها ۲۵

۳-۱-۶ محیط کشت باکتری. ۲۵

۳-۱-۷ ژل الکتروفورز. ۲۵

۳-۱-۸ مواد شیمیایی. ۲۵

۳-۱-۹ وسایل و تجهیزات ازمایشگاهی. ۲۵

۳-۲  انالیز بیوانفورماتیکی ناحیه ALCAM . 31

۳-۲-۱ استخراج توالی مورد نظر. ۳۱

۳-۲-۲ بهینه سازی توالی یا Optimization 32

۳-۳ سنتز شیمیایی DNA  ALCAM. 32

۳-۳-۱ سنتز شیمیایی ژن نوترکیب ۳۲

۳-۳-۲ پایداری و شرایط نگهداری DNA سنتز شده ۳۲

۳-۳-۳ محلول سازی DNA لیوفیلیزه ۳۳

۳-۴ کلونینگ پلاسمید- AMP+ pBSK  حاوی DNA پروتئین ALCAM 33

۳-۴-۱ اماده سازی باکتری شایسته ۳۳

۳-۴-۱-۱ مواد و محلول ها ۳۳

۳-۴-۱-۲ روش کار. ۳۴

۳-۴-۲ ترانسفورماسیون پلاسمید به سلول های مستعد TOP10  E.coli 35

۳-۴-۲-۱ روش کار ۳۵

۳-۴-۳ ارزیابی کلونی ها. ۳۶

۳-۴-۴ استخراج پلاسمید – AMP+ pBSK  حاوی DNAپروتئین ALCAM. 36

۳-۴-۵ تایید آنزیمی پلاسمید استخراج شده. ۳۸

۳-۴-۵-۱ هضم آنزیمی دوگانه یا Double digestion 39

۳-۴-۵-۲ الکتروفورز. ۳۹

۳-۵ ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM. 39

۳-۵-۱ تخلیص DNA ناحیه CD166از ژل. ۳۹

۳-۵-۲ لایگیشن ۴۳

۳-۵-۳ ترانسفورماسیون. ۴۳

۳-۵-۳-۱ اماده سازی سلول های شایسته. ۴۴

۳-۵-۳-۲ ترانسفورماسیون سلول های شایسته E.coli BL21(DE3) با محصول لایگیشن. ۴۵

۳-۵-۴ ارزیابی کلونی ها ۴۵

۳-۵-۵ استخراج پلاسمید بیانی pet-28aحاوی ژنپروتئین ALCAM 46

۳-۵-۶ تایید انزیمی پلاسمید استخراج شده. ۴۸

۳-۶  بیان پروتئین پروتئین . ۴۸

۳-۶-۱ القاء بیان پروتئین به کمک . ۴۹

۳-۶-۲ بررسی بیان به کمک تکنیک SDS-page 49

۳-۶-۲-۱ محتویات کیت.    SDS-page     . ۵۰

۳-۶-۲-۲روش انجام  SDS_page. 51

فصل چهارم: نتایج

۴-۱نتایج حاصل از  انالیز بیوانفورماتیکی پروتئین پروتئین ALCAM. 55

۴-۱-۱ نتایج حاصل از بهینه سازی توالی یا Optimization 55

۴-۲ سنتز شیمیایی DNA پروتئین ALCAM 60

۴-۳ کلونینگ پلاسمید- AMP+pBSKحاوی DNA پروتئینALCAM. 62

۴-۴ ساب کلونینگ ژن پروتئین ALCAM. 63

۴-۵ بیان پروتئین پروتئین ALCAMو تائید ان به کمک تکنیک SDS-page. 66

فصل پنجم: بحث و نتیجه گیری

بحث. ۶۸

نتیجه گیری. ۸۰

منابع ۸۱

فهرست شکل ها

شکل۱-۱.  ساختار پروتئینALCAM 4

شکل۳- ۱انکوباتور ساخت شرکت پارس طب نوین . ۲۶

شکل ۳-۲.شیکر انکوباتور. ۲۷

شکل  ۳-۳. تانک الکتروفوز افقی ۲۷

شکل ۳-۴ تانک الکتروفورز و دستگاه مولد ولتاژ. ۲۸

شکل۳-۵. سانتریفیوژ اپندورف المان ۲۹

شکل ۳-۶. بن ماری ۲۹

شکل ۳-۷. انکوباتور. ۳۰

شکل ۳-۸ دستگاه تصویرساز ژل. ۳۰

شکل ۳-۹ کیت استخراج پلاسمید فرمنتاز. ۳۶

شکل۳-۱۰ کیت استخراج DNAاز ژل فرمنتاز ۴۱

شکل ۴-۱ شاخص سازگاری کدون. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی ۵۷

شکل۴-۲ . میزان فراوانی کدون های بهینه. سمت چپ: قبل از بهینه سازی، سمت راست: بعد ازبهینه سازی. ۵۷

شکل ۴-۳ . . شاخص محتوای G-C. سمت راست: قبل از بهینه سازی، سمت چپ: بعد از بهینه سازی. ۵۷

شکل ۴-۴. ترادف احیه ژنی مورد نظر پس از بهینه سازی کدون های مربوطه جهت بیان در میزبان E.coli58

شکل ۴-۵. مقایسه نوکلئوتید بصورت نظیر به نظیر در توالی های اولیه و بهینه سازی. ۶۰

شکل ۴-۶. تائید اندازه ژن سنتز شده به کمک هضم  انزیمی   .۶۲

شکل ۴-۷. نقشه ی ژنی پلاسمید حاوی DNA. 63

شکل۴-۸تایید حضور پلاسمید حاوی پروتئینALCAM.             . ۶۴

شکل ۴-۹. هضم دوگانه انزیمی پلاسمید تکثیر یافته pBSK. 64

شکل ۴-۱۰. نقشه ژنی پلاسمید  pet-28a 63

شکل ۴-۱۱باکتری های BL21(DE3)ترانسفورم شده با pet-28a حاوی ژن. ۶۶

شکل ۴-۱۲. تائید حضور پلاسمید pet-28aحاوی ژن در باکتری ترانسفورم شده BL21(DE3). 66

شکل ۴-۱۳نتیجه حاصل از هضم انزیمی دو گانه پلاسمید pet-28aحاوی ژن ناحیه ۶۷

شکل۴-۱۴ بررسی بیان پروتیئن ناحیه.ؤ. ۶۸

چکیده

مقدمه :

سرطان کولورکتال به عنوان چهارمین سرطان شایع در دنیا با برآورد ۲/۱میلیون مورد جدید در سال می باشد. این سرطان با توجه به متاستاز به نواحی مختلف بدن به خصوص کبد و ریه در مراحل پیشرفت بیماری یکی از کشنده ترین نوع از سرطان های بدخیم می باشد.هم چنین این سرطان رتبه سومین نوع از سرطان های شایع در زنان و پنجمین نوع در میان مردان در ایران درارا می باشد.

CD166 یکی از پروتئین های سطحی سلولهای سرطانی در سرطان کولورکتال است که با سرطانی شدن سلول ها میزان بیان سطحی آن بیشتر می شود. از این جهت می توان از آن به عنوان مارکر مناسب جهت درمان سرطان استفاده کرد. در این مطالعه ما برآن شدیم که  تا با بهره گرفتن از کلون کردن و بیان پروتئین سطحی CD166 زمینه برای استفاده از آن جهت تولید واکسن و یا کیت تشخیص سرطان کولورکتال فراهم شود.

روش کار :

در این مطالعه ابتدا توالی ژن موردنظر به کمک بانک های اطلاعات ژنی انتخاب شد. سپس توالی موردنظر را آنالیز بیوانفورماتیکی قرار گرفت. ژن آنالیز شدن به روش شیمیایی سنتز شد و سپس با بهره گرفتن از فرآیند کلوینگ ، قطعه ژنی سنتز شده را به کمک پلاسمید بیانی pet-28a درون سیستم پروکاریوتی انتقال و تکثیریافت.

در انتها نیز بیان ژن موردنظر را در باکتریهای نوترکیب با القاگر مناسب القا کرده و وجود پروتئین موردنظر به کمک تکنیک sDs-page مورد بررسی قرار گرفت.

بحث و نتیجه گیری :

ژن موردنظر توانایی کلون شدن در میزبان پروکاریوتی را دارا بوده و باکتری قادر است به کمک القاگر مناسب به میزان فراوانی پروتئین موردنظر را تولید کند.

از این جهت می توان از این پروتئین نوترکیب برای تهیه کیت تشخیص سرطان کولورکتال به واسطه ی تکنیک الایزا استفاده برد. همچنین می توان با تزریق این پروتئین نوترکیب به عنوان واکسن ، سیستم ایمنی فرد را جهت پیشگیری از ابتلا به سرطان کولورکتال تقویت نمود.

واژه های کلیدی : سرطان کولورکتال ، CD166 ، کلونینگ

فصل اول : مقدمه

  • تعریف سرطان :

سرطان در سلول ها که واحد سازنده بافت ها هستند شروع می شود. به طور طبیعی سلول ها رشد می کنند و در صورت نیاز بدن ما به سلول های جدید تقسیم می شوند و وقتی پیر می شوند و سلول های جدید جای آن ها را می گیرند . گاهی این مراحل اشتباه پیش می رود ، سلول های جدید در حالی که تشکیل می شوند که بدن به آنها نیاز ندارد و سلول های پیر نمی میرند این سلول ها زیادی یک توده ی بافتی تشکیل می دهند که به آن توده یا تومور می گویند.

تومورها می توانند خوش خیم یا بدخیم باشند. تومورهای خوش خیم سرطان نیستند.

تومورهای خوش خیم :

  • تومورهای خوش خیم به ندرت تهدید کننده زندگی هستند.
  • اکثر تومورهای خوش خیم را می توان برداشت و معمولا برگشت نمی کنند.
  • تومورهای خوش خیم به بافت های اطراف تهاجم پیدا نمی کنند.

تومورهای بدخیم :

  • تومورهای بدخیم سرطان نیستند.
  • تومورهای بدخیم تهدید کننده زندگی هستند.
  • تومورهای بدخیم را اغلب می توان برداشت ولی بعضی مواقع دوباره برگشت می کنند.
  • تومورهای بدخیم می توانند به بافت ها و ارگانهای اطراف تهاجم پیدا کرده و آسیب برسانند.

تعداد صفحه : ۱۰۲

قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***

مطلب پیشنهادی
پایان نامه رشته :بیوتکنولوژی گرایش :میکروبی عنوان : انالیز بیوانفورماتیکی، کلونینگ…
Cresta Posts Box by CP