پایان نامه ارشد:مدل­سازی عوامل موثر بر تخمیر سرکه خارک تحت تیمار آغازگر استیکی غالب در آن

پایان نامه رشته علوم و صنایع غذایی

گرایش : میکروبیولوژی مواد غذایی

عنوان : مدل­سازی عوامل موثر بر تخمیر سرکه خارک تحت تیمار آغازگر استیکی غالب در آن

دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان

دانشکده صنایع غذایی

 پایان نامه جهت دریافت مدرک کارشناسی ارشد

در رشته علوم و صنایع غذایی گرایش میکروبیولوژی مواد غذایی

مدل­سازی عوامل موثر بر تخمیر سرکه خارک تحت تیمار آغازگر استیکی غالب در آن

استاد راهنما:

دکتر مرتضی خمیری

دکتر سید مهدی جعفری

اساتید مشاور:

دکتر مهدی کاشانی نژاد

دکتر علیرضا صادقی

دی ماه ۱۳۹۳

 
 
 
 
 
فصل اول
۱- مقدمه. ۲
۱-۱- فرآیند تخمیر. ۳
۱-۱-۱- مخمرها ۴
۱-۱-۲- باکتری های اسید استیکی ۵
۱-۲- باکتری های اسید استیکی در سرکه. ۷
۱-۲-۱- فرآورده تخمیری سرکه. ۷
۱-۲-۱-۱- خرما ۷
۱-۲-۱-۲- ترکیبات تشکیل دهنده خرما ۸
۱-۲-۱-۳- فرآورده های تخمیری حاصل از خرما ۹
۱-۲-۲- تولید سرکه توسط باکتری های اسید استیکی ۱۰
۱-۳- طبقه بندی باکتری های اسید استیکی ۱۱
۱-۴- شمارش، جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی ۱۳
۱-۵- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی ۱۵
۱-۶- پی سی آر (PCR). 15
۱-۶-۱- تاریخچه. ۱۶
۱-۶-۲- اساس و روش کار. ۱۸
۱-۶-۳- مراحل PCR 19
۱-۶-۴- پارامترهای مؤثر در PCR 20
۱-۷- مدل سازی ۲۱
۱-۸- فرضیات پژوهش ۲۵
۱-۹- اهداف پژوهش ۲۵
فصل دوم
۲-۱- شناسایی باکتری های اسید استیک با بهره گرفتن از روش های مدرن ۲۷
۲-۲- تولید سرکه زردآلو با بهره گرفتن از Acetobacter جدا شده از زردآلوی ایرانی ۳۴
۲-۳- تولید سرکه آناناس و بررسی تاثیر متقابل بین مخمر و باکتری اسید استیکی ۳۴
۲-۴- جداسازی و شناسایی نژاد Acetobacter از گیلاس سفید- قرمز ایرانی به عنوان نژادی با قابلیت تولید اسید بالا در تولید سرکه  ۳۶
۲-۵- بهینه سازی عوامل موثر در فرآیند تولید سرکه با بهره گرفتن از تخمیر موز. ۳۶
۲-۶- روش های مدل سازی میکروبی ۳۷
فصل سوم
۳-۱-زمان و مکان تحقیق ۴۲
۳-۲- مواد مصرفی ۴۲
۳-۲-۱- خارک خرمای هلیله ای ۴۲
۳-۲-۲- سرکه خرما ۴۲
۳-۲-۳- مواد شیمیایی ۴۳
۳-۲-۴- مواد ژنتیکی ۴۳
۳-۳- تجهیزات. ۴۴
۳-۴- اندازه گیری ترکیبات خارک خرما ۴۵
۳-۴-۱- اندازه گیری قند. ۴۵
۳-۴-۲- اندازه گیری فیبر. ۴۶
۳-۴-۳- اندازه گیری فسفر. ۴۶
۳-۴-۴- اندازه گیری کلسیم. ۴۷
۳-۴-۵- اندازه گیری پتاسیم. ۴۸
۳-۴-۶- اندازه گیری رطوبت ۴۸
۳-۴-۷- اندازه گیری خاکستر. ۴۹
۳-۴-۸- اندازه گیری پروتئین ۴۹
۳-۴- مرحله جداسازی و شناسایی باکتری های اسید استیکی و شناسایی آن ها ۵۰
۳-۴-۱- روش کشت ۵۰
۳-۴-۲- خالص سازی باکتری های استیکی ۵۱
۳-۴-۲-۱- نگهداری جدایه های باکتری های اسید استیک ۵۲
۳-۵-آزمون های تاییدی باکتری های استیکی ۵۲
۳-۵-۱-آزمون کاتالاز. ۵۲
۳-۵-۲- آزمون گرم. ۵۳
۳-۶- استخراج DNA از جدایه های باکتریایی ۵۴
۳-۷- انجام PCR و تکثیر ناحیه s rDNA16. 55
۳-۷-۱- واکنش PCR. 55
۳-۷-۲- تعیین توالی و مقایسه توالی ها ۵۶
۳-۸- مرحله تولید الکل با بهره گرفتن از مخمر. ۵۷
۳-۸-۱-تهیه سوسپانسیون مخمر. ۵۷
۳-۹- مرحله تهیه سرکه از محلول الکلی تهیه شده از تخمیر الکلی ۵۹
۳-۹-۱- انتخاب ایزوله های باکتری اسید استیک. ۵۹
۳-۹-۲- تهیه سوسپانسیون باکتری ها ۵۹
۳-۱۰- آزمون های میکروبی و شیمیایی سرکه. ۶۱
۳-۱۰-۱- آزمون میکروبی ۶۱
۳-۱۰-۲- آزمون اندازه گیری pH 61
۳-۱۰-۳- آزمون اسیدیته. ۶۲
۳-۱۰-۴- آزمون مواد جامد محلول. ۶۲
۳-۱۰-۵- آزمون اندازه گیری الکل. ۶۲
۳-۱۱- مدل سازی ۶۴
۳-۱۲- روش آماری تحلیلی داده ها ۶۴
فصل چهارم
۴-۱- اندازه گیری ترکیبات خارک. ۶۶
۴-۲- جداسازی وشناسایی فلور اسید استیکی نمونه های سرکه. ۶۷
۴-۲-۱- بررسی خصوصیات ظاهری پرگنه ها ۶۷
۴-۲-۲- آزمون های ابتدایی شناسایی (تایید اسید استیک باکتریایی بودن جدایه ها) ۶۷
۴-۲-۳- شناسایی جدایه ها در سطح جنس و گونه. ۶۸
۴-۳- انتخاب جدایه های باکتری اسید استیک ۷۰
۴-۳- تکنولوژی تولید سرکه. ۷۳
۴-۳-۱- آزمون های میکروبی ۷۳
۴-۳-۱-۱- تغییرات رشد سلولی مخمر Saccharomyces cerevisiae. 73
۴-۳-۱-۲- تغییرات رشد سلولی باکتری های اسید استیکی ۷۷
۴-۳-۲- آزمون های شیمیایی ۸۲
۴-۳-۲-۱-تغییرات pH نمونه های سرکه. ۸۲
۴-۳-۲-۲-تغییرات اسیدیته نمونه های سرکه. ۸۶
۴-۳-۲-۳- تغییرات مواد جامد محلول نمونه های سرکه. ۹۰
۴-۳-۲-۴-تغییرات الکل نمونه های سرکه. ۹۲
۴-۴- مدل سازی ۹۷
۴-۴-۱- مدل سازی رشد میکروبی ۹۷
۴-۴-۲- مدل سازی عوامل موثر بر تخمیر. ۱۰۰
فصل پنجم
۵-۱- نتیجه گیری ۱۱۱
۵-۲- پیشنهادات. ۱۱۴
منابع ۱۱۵
پیوست. ۱۲۷
 
جدول ۱-۱- واکنش مخمرها طی فرآیند تخمیر الکلی ۵
جدول ۱-۲- ترکیبات تشکیل دهنده خرما ۸
جدول ۱-۳- طبقه بندی دوازده جنس خانواده Acetobacteriacea. 11
جدول ۱-۴- روش های مولکولی شناسایی باکتری های اسید استیکی ۱۶
جدول ۱- ۵- مدل های پیشبینی رشد میکروبی ۲۳
جدول ۲-۱- شناسایی جدایه های باکتری اسید استیکی طی اسیدیفیکاسیون سرکه توسط تکنیک های متفاوت    ۲۹
جدول۲-۲- مدل های آزمایشی برای تخمیر سرکه آناناس با بهره گرفتن از yeast-S. cerevisiae M30  و AAB-A. aceti WK 34
جدول ۳-۱- لیست مواد شیمیایی مورد استفاده در این پژوهش ۴۱
جدول ۳-۲- لیست مواد ژنتیکی مورد استفاده در این پژوهش ۴۲
جدول ۳-۳- لیست تجهیزات مورد استفاده در این پژوهش ۴۲
جدول ۳-۴- میزان مواد استفاده شده در واکنش PCR 55
جدول۳-۵- مراحل انجام واکنش PCR 56
جدول ۳-۶- نحوه تیماربندی جهت افزودن سوسپانسیون های مخمر و باکتری ۶۱
جدول ۴-۱- ترکیبات اصلی خارک خرما رقم “هلیله ای”. ۶۷
جدول ۴-۲ جدایه های مورد استفاده در واکنش PCR 69
جدول ۴-۳- مقایسه میزان اسیدیته و pH 30 جدایه اسید استیکی ۷۱
جدول ۴-۴- مقایسه میزان رشد، مصرف الکل، اسیدیته و pH 12 جدایه اسید استیکی ۷۲
جدول ۴-۵- نتایج حاصل از توالی یابی جدایه ها ۷۳
جدول ۴-۶- مقایسه میانگین شمارش مخمر در طول ۱۵ روز نگهداری ۷۵
جدول ۴-۷- مدل سازی رشد مخمر طی تخمیر الکلی سرکه خارک خرما ۹۸
جدول ۴-۸- مدل سازی رشد باکتری های اسید استیکی طی تخمیر استیکی سرکه خارک خرما ۹۹
جدول ۴-۹- مدل های ارائه شده برای تغییرات بریکس با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از ۲۰، ۳۰ و ۴۰ درصد خارک خرما ۱۰۴
جدول ۴-۱۰- مدل های ارائه شده برای تغییرات pH با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از ۲۰، ۳۰ و ۴۰ درصد خارک خرما ۱۰۵
جدول ۴-۱۱- مدل های ارائه شده برای تغییرات اسیدیته با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از ۲۰، ۳۰ و ۴۰ درصد خارک خرما ۱۰۶
جدول ۴-۱۲- مدل های ارائه شده برای تغییرات الکل با رشد باکتری A.pasteurianus در عصاره های الکلی حاصل از ۲۰، ۳۰ و ۴۰ درصد خارک خرما ۱۰۷
جدول ۴- ۱۳- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات بریکس ۱۰۸
جدول ۴- ۱۴- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات pH 108
جدول ۴- ۱۵- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات اسیدیته. ۱۰۹
جدول ۴- ۱۶- جدول مقایسه ضرایب همبستگی و میزان خطا برای تغییرات الکل ۱۰۹
شکل ۳-۱- روش کشت سطحی ۵۱
شکل ۳-۲- مراحل جداسازی جدایه های باکتریایی ۵۳
شکل ۳-۳- مرحله تخمیر الکلی تولید سرکه خارک خرما ۵۸
شکل ۳-۴- مرحله اسیدیفیکاسیون تولید سرکه خارک خرما ۶۰
شکل ۳-۵- اندازه گیری الکل نمونه ها ۶۳
شکل ۴-۱- تصویر محصولات PCR در ژل الکتروفورز. ۷۰
شکل ۴-۲- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر ۲۰ درصد خارک خرما طی ۱۵ روز  ۷۹
شکل ۴-۳- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر ۳۰ درصد خارک خرما طی ۱۵ روز  ۸۰
شکل ۴-۴- تغییرات سلولی باکتری های اسید استیکی در عصاره الکلی حاصل از تخمیر ۴۰ درصد خارک خرما طی ۱۵ روز  ۸۰
شکل ۴-۵- تغییرات pH در مرحله تخمیر الکلی ۸۲
شکل ۴-۶- تغییرات pH در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی ۸۴
شکل ۴-۷- تغییرات اسیدیته در مرحله تخمیر الکلی ۸۶
شکل ۴-۸- تغییرات اسیدیته در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی ۸۸
شکل ۴-۹- تغییرات مواد جامد محلول طی تخمیر الکلی و استیکی در غلظت ۲۰ درصد خارک خرما طی ۱۵ روز  ۹۰
شکل ۴-۱۰- تغییرات مواد جامد محلول با بهره گرفتن از جدایه های استیکی در غلظت ۳۰ درصد خرما طی ۱۵ روز  ۹۱
شکل ۴-۱۱- تغییرات مواد جامد محلول با بهره گرفتن از جدایه های استیکی در غلظت ۴۰ درصد خرما طی ۱۵ روز  ۹۱
 
شکل ۴-۱۲- تغییرات الکل در مرحله تخمیر الکلی ۹۳
شکل ۴-۸- تغییرات الکل در عصاره های الکلی خارک خرما طی تخمیر استیکی ۹۴
 
پیوست “الف”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان مواد جامد محلول (TSS)  ۱۲۸
پیوست “ب”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان pH 129
پیوست “ج”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان اسیدیته. ۱۳۰
پیوند “د”- مقایسه میانگین اثر جدایه در  غلظت های مختلف از ماده اولیه بر میزان الکل ۱۳۱
پیوست “ه”- مقایسه میانگین شمارش باکتری های استیکی در طول ۱۵ روز نگهداری ۱۳۲
پیوست “و”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter pasteurianus در NCBI منطبق با توالی جدایه FR22  ۱۳۳
پیوست “ز”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR22 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 134
پیوست “ح”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter aceti در NCBI منطبق با توالی جدایه FR43  ۱۳۵
پیوست “ط”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR43 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 136
پیوست “ی”- توالی ناحیه s rRNA16 برای باکتری Acetobacter tropicalis در NCBI منطبق با توالی جدایه FR61  ۱۳۷
پیوست “ک”- مقایسه میزان مشابهت توالی جدایه FR61 با توالی تطبیق یافته در NCBI. 138

فصل اول

 
مقدمه و کلیات
 
 

     ۱- مقدمه

سرکه فرآورده­ای است که از مواد مختلف قندی و نشاسته­ای از طریق تخمیر الکلی و استیکی تهیه می­شود. سرکه می ­تواند از مواد خام مختلف و با روش­های متفاوت تولید گردد. در گذشته از سرکه به ­عنوان نگهدارنده استفاده می­شد به­ طوری که یا به­صورت طبیعی در ماده غذایی تولید می­گردید و یا به آن اضافه می­شد تا از رشد میکروبی نامطلوب در ماده غذایی جلوگیری کرده و ویژگی­های حسی آن را حفظ نماید (دی اوری و همکاران، ۲۰۰۲). استیک اسید یک طعم­دهنده و ترکیب ضد­میکروبی در سرکه می­باشد. همچنین مطالعاتی در زمینه اهمیت اسید استیک به ­عنوان یک افزودنی غذایی جهت کمک به فرآیندهای غذایی به­منظور از بین بردن آلودگی قبل از توزیع و مصرف انجام گرفته است (مارشال و همکاران، ۲۰۰۰).
فرآیندهای مورد استفاده برای تولید سرکه، شامل فرآیند اورلئانز[۱] (به ­عنوان فرآیند آهسته شناخته        می­شود)، فرآیند سریع (به نام فرآیند ژنراتور نیز شناخته می­شود) و فرآیند کشت غرقابی[۲] می­باشد. فرآیندهای سریع و غرقابی توسعه یافته­اند و جهت تولید صنعتی و تجاری سرکه مورد استفاده می­باشند.
تولید اسید استیک طی چهار مرحله انجام می­شود: تبدیل نشاسته به ساکارز توسط آنزیم آمیلاز، تبدیل بی­هوازی ساکارز به اتانول از طریق تخمیر الکلی توسط مخمر، تبدیل اتانول به استالدهید هیدراته و دهیدروژناسیون توسط آلدهید دهیدروژناز و تولید اسید استیک. دو مرحله آخر به­صورت هوازی وتوسط باکتری­های اسید استیکی انجام می­گیرد (تان، ۲۰۰۳). باکتری­های اسید استیکی که به ­عنوان باکتری سرکه نیز شناخته می­شوند، از باکتری­های هوازی مطلق هستند که دارای قابلیت اکسیداسیون الکل به اسید استیک می­باشند. باکتری­های اسید استیکی به خانواده Acetobacteriacea و جنس Acetobacter تعلق دارند و برای تولید صنعتی سرکه مناسب می­باشند. باکتری­های اسید استیکی به دلیل مقاومت بالا در برابر اسید و همچنین تنوع سوبسترای مصرفی جهت تولید انرژی، در طبیعت دیده می­شوند. این باکتری­ها تاکنون از منابع مختلفی از جمله نوشیدنی­های الکلی،‌ سرکه، میوه­ها، گل­ها، عسل، خاک و آب جداسازی شده ­اند. جداسازی باکتری­های اسید استیکی با توان بالای تولید اسید و مقاوم در برابر اسید توسط محققین مختلف مورد مطالعه قرار گرفته است. با این وجود به دلیل دانش کمتر در زمینه فیلوژنتیکی باکتری­های اسید استیکی همچنان نیاز به جداسازی و شناسایی این گروه باکتریایی احساس می­شود (برگی، ۱۹۵۷). امروزه از آنالیز ناحیه S rDNA16 در ژن باکتری به منظور شناخت روابط فیلوژنتیکی میان باکتری­های اسید استیکی و شناسایی آن­ها در محصولات مختلف به­طور گسترده استفاده می­گردد. بنابراین تکثیر این ناحیه در باکتری­های اسید استیکی توسط واکنش­های زنجیره­ای پلیمراز (PCR)[3]، به ­عنوان روش شناسایی سریع و دقیق، مورد استفاده قرار می­گیرد. هدف از این پژوهش در مرحله اول جداسازی و شناسایی باکتری­های اسید استیکی موجود در سرکه خرما و در مرحله دوم استفاده از جدایه­های شناسایی شده جهت تولید سرکه خارک خرما و مدل­سازی عوامل موثر بر تخمیر این فرآورده می­باشد.
 

۱-۱- فرآیند تخمیر

تخمیر یک فرآیند متابولیک می­باشد که در سلول به ­عنوان یک مسیر برای تولید انرژی به شمار می­آید و طی آن مولکولی چون گلوگز در شرایط بی­هوازی شکسته می­شود. در بیشتر سلول­ها این عمل در بخش حاوی مایع سیتوپلاسمی صورت می­گیرد. علم مطالعه فرآیندهای تخمیری را زیمولوژی[۴] می­نامند. از سال­ها پیش، فرآیند تخمیر جهت تولید مواد غذایی و نوشیدنی­ها مورد استفاده قرار گرفته است. به ­عنوان مثال، در محصولاتی مانند ترشی­ها، خیار شور، کیمچی، ماست، سرکه و نوشیدنی­های نخمیری فرآیند تخمیر جهت تولید اسید استیک و اسید لاکتیک استفاده می­شود. همچنین اسید موجود در این محصولات منجر به حفظ محصول در مدت زمان طولانی­تری می­شود. فرآیند تخمیر صنعتی توسط میکروارگانیسم­های مناسب و در شرایط تعریف­شده مانند غلظت مشخصی از مواد مغذی انجام می­گیرد. محصولات تولیدی حاصل از تخمیر متنوع می­باشد: الکل، گلیسرول و دی­اکسید کربن از تخمیر قندهای مختلف توسط مخمرها ؛ بوتیل الکل، استون،‌ لاکتیک اسید، مونوسدیم گلوتامات و اسید استیک توسط انواع مختلفی از باکتری­ها و مقدار اندکی آنتی­بیوتیک، ویتامین ۱۲B و ریبوفلاوین (ویتامین ۲B) از تخمیر قارچ­ها تولید می­شود (لیو و همکاران، ۲۰۰۴).
 

۱-۱-۱- مخمرها

تخمیر الکلی یا به­صورت طبیعی و یا کشت خالص انجام می­گیرد. در تخمیر طبیعی، مخمرهای موجود در ماده اولیه فرآیند تخمیر را پیش می­برند. در تخمیر به­صورت کشت خالص، نژادهای مشخصی از مخمر که معمولاSaccharomyces cerevisiae  می­باشد، انتخاب شده و با جمعیتی حدود cfu/ml107-106 به محصول تلقیح می­گردد. به­طور کلی، تخمیر کشت خالص فرآیند تخمیر سریع­تر و قابل پیش ­بینی­تری محسوب می­شود. تخمیر طبیعی متابولیت­های نهایی بیشتری تولید می­ کند و به دلیل حضور محدوده وسیع­تری از مخمرها، این نوع تخمیر جهت تولید نوشیدنی­های الکلی مورد توجه می­باشد (بوردیکون و همکاران، ۲۰۱۲).
در طول تخمیر الکلی، مخمرها میکروارگانیسم­های غالب را تشکیل می­ دهند. ترکیب محیط تخمیر، خصوصا محتوای اسیدها و قندها، و pH محیط برای رشد مخمرها و تولید اتانول مناسب می­باشد اما از رشد و تکثیر باکتری­ها و قارچ­ها جلوگیری می­ کند. در تخمیر طبیعی، الگوی مشخصی برای رشد مخمرها وجود دارد که در جدول ۱-۱ ارائه شده است. فرآیند تخمیر با رشد مخمرهای مختلفی شامل Kloeckera ، Hanseniaspora ، Candida ، Metschnikowia و ساکارومایسز سرویزیه آغاز می­گردد. در برخی موارد رشد Pichia و Kluyveromyces نیز دیده می­شود. رشد مخمرها به جز جنس ساکارومایسز، در مدت ۴-۲ روز اول تخمیر وجود خواهد داشت و پس از آن مخمرها از بین می­روند. با این وجود در مرحله رشد به جمعیتی در حدود cfu/ml107-106 افزایش می­یابند. علت مرگ سلول­های مخمر عدم توانایی تحمل غلظت­های بالای اتانول می­باشد که بخش عمده آن توسط ساکارومایسر سرویزیه تولید می­گردد. تحقیقاتی که در طول سال­ها و در کشورهای مختلف انجام گرفته، نشان داده است که ساکارومایسز سرویزیه مخمر غالب در بیشتر تخمیرهای الکلی می­باشد. بنابراین به ­عنوان مخمر اصلی و آغازگر صنعتی در تخمیر الکلی شناخته می­شود. گفته می­شود که تلقیح مخمر ساکارومایسز سرویزیه جهت انجام تخمیر نسبت به تخمیر طبیعی مناسب­تر می­باشد. با این وجود، مخمرهای تلقیح شده باید با مخمرهای طبیعی رقابت کنند اما به نظر نمی­رسد که این مخمرها قادر به غلبه بر مخمرهای طبیعی و تشکیل مخمرهای غالب باشند (فلیت، ۱۹۹۸).
[۱] Orleans Process
[۲] Submerged culture process
[۳] Polymerase Chain Reaction
[۴] Zymogoly
تعداد صفحه :۱۵۴
قیمت : ۱۴۷۰۰ تومان

بلافاصله پس از پرداخت لینک دانلود فایل در اختیار شما قرار می گیرد

و در ضمن فایل خریداری شده به ایمیل شما ارسال می شود.

پشتیبانی سایت :        ****       [email protected]

در صورتی که مشکلی با پرداخت آنلاین دارید می توانید مبلغ مورد نظر برای هر فایل را کارت به کارت کرده و فایل درخواستی و اطلاعات واریز را به ایمیل ما ارسال کنید تا فایل را از طریق ایمیل دریافت کنید.

***  *** ***

مطلب پیشنهادی
پایان نامه رشته جنگل­ شناسی و اکولوژی جنگل عنوان : روش­های…
Cresta Posts Box by CP